PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

This study aims to establish a therapy strategy for canine leukopenia induced by canine parvovirus (CPV) infection through intravenous infusion of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) and to evaluate the therapeutic effect of BMMSCs on canine parvovirus. Forty healthy 2-month-old dogs were randomly divided into four groups including the BMMSC treatment group (A), conventional treatment group (B), CPV infection group (C), and a normal control group (D). Then the A, B, and C groups were orally infected with CPV (103.25 TCID50/mL) at 1mL/kg, and the D group received the same dose of saline. After the onset of infection, Group A received mesenchymal stem cells (MSCs) and rehydration as the treatment; Group B was treated with anti-inflammatory therapeutics and rehydration; and Group C and D were injected with the same dose of physiological saline. The level of leukocytes rebounded significantly after the treatment with BMMSCs and returned to reference numbers on Day 3 after treatment, which was significantly higher than that in the conventional treatment group. The concentrations of IL-2 and IFN-α were gradually increased during the treatment, and the BMMSC treatment group exhibited significantly higher IL-2 and IFN-α concentrations than the conventional treatment group on Days 3 and 4. The expression of the virus in the blood gradually decreased during the treatment, and the BMMSC treatment group displayed a faster decrease than the conventional treatment group. These results showed the advantages of BMMSC treatment over conventional treatment. This study provides a new BMMSC treatment strategy for canine leukopenia induced by CPV infection and reveals the mechanism by which BMMSC increases leukocytes after CPV infection.

• Allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells dog leukopenia parvovirus infection

Abstract in Portuguese:

Este estudo tem como objetivo estabelecer uma estratégia terapêutica de leucopenia canina induzida pela infecção por parvovírus canino (CPV) através de infusão intravenosa de células tronco mesenquimais da medula óssea alogênica (BMMSCs) e avaliar o efeito terapêutico de BMMSCs no parvovírus canino. Quarenta cães saudáveis de dois meses de idade foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: o grupo de tratamento de BMMSCs (A), o grupo de terapia convencional (B), o grupo de infecção por CPV (C) e um grupo controle (D). Os grupos A, B e C foram infectados oralmente com CPV (103.25 TCID50/mL) a 1mL/kg e o D recebeu a mesma dose de soro fisiológico. Após o início da infecção, o grupo A recebeu uma dose de derivadas da medula óssea (CTMMO) e hidratação como tratamento, o grupo B foi tratado com terapia anti-inflamatória e hidratação, e grupos C e D foram injetados com a mesma dose de soro fisiológico. As concentrações de IL-2 e IFN-α aumentaram gradualmente durante o tratamento, e o grupo de tratamento BMMSC mostrou concentrações significativamente maiores de IL-2 e IFN-α do que o grupo de tratamento convencional nos Dias 3 e 4. A expressão de vírus no sangue diminuiu gradualmente durante o tratamento, e o grupo de tratamento BMMSC mostrou uma diminuição mais rápida do que o grupo de tratamento convencional. Esses resultados mostraram as vantagens do tratamento BMMSC em relação ao tratamento convencional. Este estudo fornece uma nova estratégia de tratamento da BMMSC para leucopenia canina induzida pela infecção por VCP e revela o mecanismo pelo qual a BMMSC aumenta os leucócitos após infecção por VCP.

• Alogênico células-tronco mesenquimais da medula óssea cão caninos leucopenia infecção por parvovirus

Abstract in English:

ABSTRACT.- Maia L., Landim-Alvarenga F.C., Golim M.A., Sudano M.J., Taffarel M.O., De Vita B., Freitas N.P.P. & Amorim R.M. 2012. [Potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells from equine bone marrow.] Potencial de transdiferenciação neural das células-tronco mesenquimais da medula óssea de equino. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(5):444-452. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Júnior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: leandromvet@hotmail.com The first studies showing the potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow (BM) were conducted in camundogos and humans in the early 2000s. After this period, the number of research and publications with the same purpose increased, but with rare or scarce studies in horses. The aim of this study was to evaluate in vitro neuronal transdifferentiation potential of MSCs from equine BM using two protocols: P1 (forksolin and retinoic acid) and P2 (2-&#946;mecarptoetanol). After confirming the mesenchymal lineages, by positivity for the marker CD90 (X=97.94%), negative for the marker CD34 and positive response for osteogenic differentiation, MSCs were subjected to neural transdifferentiation (P1 and P2) for morphological analysis and expression of neural markers GFAP and &#946;3 tubulin by flow cytometry. The results revealed morphological changes in varying degrees between the tested protocols. In protocol 1, twenty four hours after incubation with the media of neural differentiation, a large proportion of cells (>80%) had similar morphology to neural cells, characterized by retraction of cellular body and a large number of cytoplasmic extension (filopodia). However, comparatively, within the first 30 minutes after exposure to the antioxidant &#946;-mercaptoethanol (P2) MSCs showed rapid morphological changes characterized mainly by retraction of cellular body and less cytoplasmic extension. It was also evidenced with the use of this protocol, lower cellular adhesion after exposure to media when compared to P1. Regarding the immunophenotyping analysis it was observed a higher (P<0.001) expression of the markers GFAP and &#946;3 tubulin at the end of P2 compared to P1. The ability of MSCs to generate cell types related to neural lineage is complex and multifactorial, depending not only of inducing agents, but also the environment in which these cells will be cultivated. Thus a greater number of studies are necessary to better understand the process of neural transdifferentiation of MSCs from equine.

• Bone marrow neural differentiation stem cells mudula óssea diferenciação neural células-tronco

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Maia L., Landim-Alvarenga F.C., Golim M.A., Sudano M.J., Taffarel M.O., De Vita B., Freitas N.P.P. & Amorim R.M. 2012. [Potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells from equine bone marrow.] Potencial de transdiferenciação neural das células-tronco mesenquimais da medula óssea de equino. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(5):444-452. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Distrito de Rubião Júnior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: leandromvet@hotmail.com Os primeiros estudos demonstrando o potencial de trandiferenciação neural das células-tronco mesenquimais (CTMs) provenientes da medula óssea (MO) foram conduzidos em camundogos e humanos no início da década de 2000. Após esse período, o número de pesquisas e publicações com o mesmo propósito tem aumentado, mas com raros ou escassos estudos na espécie equina. Nesse sentindo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial in vitro da transdiferenciação neural das CTMs provenientes da MO de equinos utilizando-se dois protocolos: P1 (forksolin e ácido retinóico) e P2 (2-&#946;mecarptoetanol). Após a confirmação das linhagens mesenquimais, pela positividade para o marcador CD90 (X=97,94%), negatividade para o marcador CD34 e resposta positiva a diferenciação osteogênica, as CTMs foram submetidas a transdiferenciação neural (P1 e P2) para avaliação morfológica e expressão dos marcadores neurais GFAP e &#946;3 tubulina por citometria de fluxo. Os resultados revelaram mudanças morfológicas em graus variados entre os protocolos testados. No protocolo 1, vinte quatro horas após a incubação com o meio de diferenciação neural, grande proporção de células (>80%) apresentaram morfologia semelhante a células neurais, caracterizadas por retração do corpo celular e grande número de projeções protoplasmáticas (filopodia). Por outro lado, de forma comparativa, já nos primeiros 30 minutos após a exposição ao antioxidante &#946;-mercaptoetanol (P2) as CTMs apresentaram rápida mudança morfológica caracterizada principalmente por retração do corpo celular e menor número de projeções protoplasmáticas. Também ficou evidenciado com o uso deste protocolo, menor aderência das células após tempo de exposição ao meio de diferenciação, quando comparado ao P1. Com relação a análise imunofenotípica foi observado uma maior (P<0,001) expressão dos marcadores GFAP e &#946;3 tubulina ao término do P2 quando comparado ao P1. A habilidade das CTMs em gerar tipos celulares relacionados a linhagem neural é complexa e multifatorial, dependendo não só dos agentes indutores, mas também do ambiente no qual estas células são cultivadas. Desta forma um maior número de estudos é necessário para o melhor entendimento do processo de transdiferenciação neural a partir de CTMs de equinos.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Lima S.A.F., Wodewotzky T.I., Lima-Neto J.F., Beltrão-Braga P.C.B. & Alvarenga F.C.L. 2012. [In vitro differentiation of mesenchimal stem cells of dogs into osteogenic precursors.] Diferençiação in vitro de células-tronco mesenquimais da medula óssea de cães em precursores osteogênicos. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(5):463-469. Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Distrito de Rubião Júnior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: silviavet@usp.br The aim of our research was to evaluate the potential for osteogenic differentiation of mesenchimal stem cells (MSC) obtained from dog bone marrow. The MSC were separated using the Ficoll method and cultured under two different conditions: DMEM low glucose or DMEM/F12, both containing L-glutamine, 20% of FBS and antibiotics. MSC markers were tested, confirming CD44+ and CD34- cells with flow cytometry. For osteogenic differentiation, cells were submitted to four different conditions: Group 1, same conditions used for primary cell culture with DMEM supplemented media; Group 2, same conditions of Group 1 plus differentiation inductors Dexametazone, ascorbic acid and b-glicerolphosphate. Group 3, Cells cultured with supplemented DMEM/F12 media, and Group 4, same conditions as in Group 3 plus differentiation inductors Dexametazone, ascorbic acid and b-glicerolphosphate. The cellular differentiation was confirmed using alizarin red and imunostaining with SP7/Osterix antibody. We observed by alizarin staining that calcium deposit was more evident in cells cultivated in DMEM/F12.Furthermore, by SP/7Osterix antibody immunostaining we obtained 1:6 positive cells when using DMEM/F12 compared with 1:12 for low-glucose DMEM. Based on our results, we conclude that the medium DMEM/F12 is more efficient for induction of differentiation of mesenchymal stem cells in canine osteogenic progenitors. This effect is probably due to the greater amount of glucose in the medium and the presence of various amino acids.

• Mesenchymal stem cell osteogenic differentiation células-tronco mesenquimais diferenciação osteogênica

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Lima S.A.F., Wodewotzky T.I., Lima-Neto J.F., Beltrão-Braga P.C.B. & Alvarenga F.C.L. 2012. [In vitro differentiation of mesenchimal stem cells of dogs into osteogenic precursors.] Diferençiação in vitro de células-tronco mesenquimais da medula óssea de cães em precursores osteogênicos. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(5):463-469. Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Distrito de Rubião Júnior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: silviavet@usp.br O objetivo principal da nossa pesquisa foi avaliar o potencial de diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (MSC) obtidas da medula óssea do cão. As MSC foram separadas pelo método Ficoll e cultivadas sob duas condições distintas: DMEM baixa glicose ou DMEM/F12, ambos contendo L-glutamina, 20% de SFB e antibióticos. Marcadores de MSC foram testados, confirmando células CD44+ e CD34- através da citometria de fluxo. Para a diferenciação osteogênica, as células foram submetidas a quatro diferentes condições: Grupo 1, as mesmas condições utilizadas para a cultura de células primárias com os meios DMEM baixa glicose suplementado; Grupo 2, as mesmas condições do Grupo 1, mais os indutores de diferenciação dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato; Grupo 3, células cultivadas com meios DMEM/F12 suplementado; e Grupo 4, nas mesmas condições que no Grupo 3, mais indutores de diferenciação de dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato. A diferenciação celular foi confirmada através da coloração com alizarin red e da imunomarcação com o anticorpo SP7/Osterix. Nós observamos através da coloração com alizarin red que o depósito de cálcio foi mais evidente nas células cultivadas em DMEM/F12. Além disso, usando a imunomarcação com o anticorpo SP/7Osterix obtivemos positividade em 1:6 células para o Meio DMEM/F12 comparada com 1:12 para o meio DMEM-baixa glicose. Com base nos nossos resultados concluímos que o meio DMEM/F12 é mais eficiente para a indução da diferenciação de células-tronco mesenquimais caninas em promotores osteogênicos. Este efeito provavelmente ocorre em decorrência da maior quantidade de glicose neste meio, bem como da presença de diversos aminoácidos.